北京皮炎专科医院 http://baidianfeng.39.net/a_yufang/210403/8811252.html本文刊登于《现代妇产科进展》年第30卷第6期杨旎，陈飞，孔令华，等.p16/Ki-67双染在高级别宫颈上皮内瘤变诊断中的应用价值[J].现代妇产科进展，，30（6）:-DOI：10./j.cnki.xdfckjz..06.作者：杨旎，陈飞，孔令华，霍霄，沈铿作者单位：中国医学科学院北京协医院妇产科通信作者：沈铿Email:shenkengpumch.cn目的：比较细胞学p16/Ki-67双染检测和高危型人乳头瘤病*（hrHPV）检测对细胞学为无明确意义的非典型鳞状细胞（ASCUS）患者的分流作用与诊断效能。方法：收集细胞学诊断为ASCUS，同时行hrHPV检测，并有宫颈组织病理学检查结果的患者信息。将剩余宫颈上皮脱落细胞标本进行p16/Ki-67免疫细胞化学双染检测，对比细胞学p16/Ki-67双染检测和hrHPV对宫颈上皮内瘤变(CIN2)级及以上病变的诊断效能。收集宫颈组织学标本，进行p16/Ki-67组织学双染，比较组织学p16/Ki-67双染结果与病理的符合度。结果：细胞学p16/Ki-67双染的阳性率与病变程度大致呈正比，符合度高于hrHPV检测（P=0.）；双染检出CIN2+的特异度（58.54%vs21.95%,P=0.4）、总体符合率（65.38%vs36.54%,P=0.）、阳性预测值（37.04%vs23.81%,P=0.）、阴性预测值（96.00%vs90.00%,P=0.）和Kappa系数（0.vs0.）均优于hrHPV检测，可减少28.9%的阴道镜分流。组织学p16/Ki-67双染的阳性率与病变程度大致呈正比。结论：细胞学p16/Ki-67双染是一个较好的宫颈癌筛查分流手段，可提高CIN2+检出效能，降低误诊率及过度治疗。组织学p16/Ki-67双染是一组良好的生物学标记物，可辅助宫颈病变的诊断。人乳头瘤病*；宫颈上皮内瘤变；p16/Ki-67双染宫颈癌发病率居全球女性癌症发病率第二位［1］，中国女性生殖系统恶性肿瘤首位［2］。近年来，世界卫生组织（worldhealthorganization,WHO）将宫颈癌预防作为优先事项［3］，其病死率明显下降，但资源匮乏地区由于缺乏合适的筛查计划，仍然面临极大的负担。因此，HPV的免疫，筛查和治疗宫颈癌仍至关重要［4］。目前临床使用的筛查手段并不完美，高危型人乳头瘤病*（highriskhumanpapillomavirus,hrHPV）检测误诊率高，许多妇女接受了不必要的检查与治疗；细胞学筛查准确性低、结果可重复性差、医生工作负荷过重。多项研究发现，宫颈癌的发生、发展及预后与肿瘤抑制基因p16和增殖细胞核抗原Ki-67有关［5］。Schmidt等［6］发现，若在一个细胞中同时检测到p16和Ki-67共表达，则高度提示有宫颈高级别上皮内瘤变的存在，是近年来一种较新的宫颈病变检测手段。宫颈癌或癌前病变的细胞发生形态学改变通常较晚，在不依赖于细胞形态，结合细胞学p16/Ki-67双染检测，可提高宫颈上皮内瘤变（cervicalintraepithelialneoplasia,CIN）2+的检出率，减少创伤性检查。本文比较了细胞学p16/Ki-67双染检测和hrHPV检测对ASCUS患者的分流作用与诊断效能，判断p16/Ki-67双染作为生物标记物在病理诊断中的价值。1材料与方法1.1病例与标本收集年4月1日到年5月30医院妇产科门诊收治的52例细胞学诊断为无明确意义的非典型鳞状细胞（atypicalsquamouscellsofunderminedsignificance,ASCUS），同时行hrHPV检测，并有宫颈组织病理学检查结果的患者信息，将其剩余宫颈上皮脱落细胞标本进行p16/Ki-67免疫细胞化学双染检测。收集年3月1日至年3月1医院进行阴道镜、锥切或全子宫切除的例宫颈组织学标本，进行p16/Ki-67组织学双染检测，由2名病理学家进行判读及评分。从病历系统获取患者病史及随诊信息。纳入标准：年龄大于20岁；有性生活史，未妊娠；无子宫颈切除术史；细胞学双染组患者经液基细胞学检查(liquid-basedcytologytest,LCT)确诊为ASCUS，遵循TBS诊断标准［7］。排除标准：妊娠期或哺乳期妇女；参与其他临床研究者。本研究已获得伦理委员会审查。1.2实验方法细胞学双染：宫颈细胞学采用Thinprep(Hologic公司，Massachusetts，USA)液基薄片法，hrHPV检测采用Cobas检测系统（Roche诊断产品公司，Newjersey,USA）。将收集的宫颈脱落细胞剩余标本在BDSurePath载玻片上制备一张薄片，采用全自动免疫组化分析仪（型号为BenchmarkGX）进行染色（Roche诊断产品公司，Newjersey,USA），试剂盒为Roche诊断产品公司的配套试剂CINtecPLUS。组织学双染：将组织蜡块制片，采用全自动免疫组化分析仪进行染色（Roche诊断产品公司，Newjersey,USA），试剂盒为Roche诊断产品公司的配套试剂p16/Ki-67组织学双染试剂。整个操作过程严格按说明书进行。1.3诊断标准细胞学双染：p16定位于胞质，显棕色；Ki-67定位于胞核，显红色。当满足1个细胞质显棕色（p16），同时胞核显红色（Ki-67），则结果为双染阳性，无需考虑细胞形态，单独显色或不显色为阴性［8］。细胞学检查采取巴氏染色法，遵循TBS诊断标准［7］。组织学双染：使用美国阴道镜检查与宫颈病理学会（ASCCP）宫颈病理指南为诊断标准，结合相应的HE染色结果，由2名病理医生在不了解患者病历信息情况下进行阅片，根据表1的评分系统［9］，将组织学双染片进行评分。1.4统计学处理采用SPSS26.0统计软件包。计数资料采用χ2检验。计量资料比较采用方差分析。计算p16/Ki-67双染检测及hrHPV检测方法的灵敏度、特异度、总符合率、阳性预测值、阴性预测值及Kappa系数。α=0.05为检验水准。2结果2.1细胞学双染根据《WHO女性生殖器官肿瘤学分类（第4版）解读》［10］，CIN被分为低级别上皮内瘤变（low-gradesquamousintraepitheliallesions，LSIL）和高级别上皮内瘤变（high-gradeintraepithelialneoplasia，HSIL）。《中国子宫颈癌筛查及异常管理相关问题专家共识（二）》［11］指出，CIN2中的p16/Ki-67双染阴性的患者仍归为LSIL。为与临床相统一，本部分仍把HSIL分为CIN2和CIN3，进一步观察p16/Ki-67双染与hrHPV检测对ASCUS患者的诊断效能。52例细胞学诊断为ASCUS的患者，其中组织病理金标准诊断结果正常患者32例，CIN1患者9例，CIN2患者3例，CIN3患者5例，宫颈癌患者3例。不同病变程度患者hrHPV和p16/KI-67双染阳性率的比较，见表2。p16/Ki-67双染的阳性率与病变程度大致呈正比，特别是在正常和LSIL患者中，p16/Ki-67双染比hrHPV检测符合度更高（P=0.）。若以hrHPV阳性或p16/Ki-67双染阳性作为ASCUS患者的阴道镜分流标准，两者分别会使42例（80.8%），27例（51.9%）患者转诊阴道镜检查，p16/Ki-67双染可减少28.9%的阴道镜分流。分别计算hrHPV和p16/Ki-67双染在检出CIN2+的诊断效能，见表3。两者的灵敏度均为90.91%，但p16/Ki-67双染检出CIN2+的特异度、总体符合率、阳性预测值、阴性预测值和Kappa系数均优于hrHPV检测。2.2组织学双染例患者中，病理诊断结果正常患者8例，LSIL患者46例，HSIL患者59例，宫颈微小浸润癌（microinvasivecarcinoma，MIC）患者38例，宫颈癌患者2例。p16/Ki-67双染的阳性率与病变程度大致成正比，见表4。3讨论近年来hrHPV检测在宫颈癌筛查中所占的角色越来越重要，已被一些国家作为初筛手段纳入宫颈癌筛查体系，但超过90%的HPV感染可自然消退［12］。同时，病理细胞学医生缺乏，诊断结果可重复性差，制片质控参差不齐，也限制了其发展。p16/Ki-67双染检测操作简单、系统，无内源性生物素干扰，易于观察,其原理依据为p16蛋白是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，其过表达提示细胞处于细胞周期的阻滞期。Ki-67反映细胞周期进展及增殖活跃，其阳性提示宫颈细胞处于细胞周期的增殖期。正常生理状态下，p16和Ki-67的表达相互制约，达到一种动态平衡的状态，不会同时出现在同一个细胞中，二者共表达提示细胞周期调控失调［13］。本研究结果进一步验证p16/Ki-67双染有助于识别病变细胞。hrHPV阳性是临床上常见的筛查异常结果，结合细胞学结果许多患者的处理流程是转诊阴道镜。Liu等［14］研究表明，平均随访2年，仅有2.4%细胞学阴性且hrHPV阳性患者进展为CIN2。Yang等［15］研究细胞学阴性且hrHPV阳性患者3年CIN3+累积风险为6.8%，由此可见，以hrHPV阳性作为宫颈癌筛查方法或分流手段会造成过高的阴道镜转诊率，造成了大量的医疗资源浪费。本研究结果显示，p16/Ki-67双染的阳性率与病变程度大致呈正比，特别是在CIN2-的患者中，比hrHPV检测结果符合度更高，降低假阳性率，使患者避免不必要的有创检查或治疗。本研究结果显示，hrHPV和p16/Ki-67双染对检出CIN2+的敏感性相同，但p16/Ki-67双染误诊率低，与病理金标准符合率更高，结果与Peeters等［16］荟萃分析结果相符；并且，p16/Ki-67双染读片简单易行，对单纯细胞学读片也有辅助作用，对于医疗资源不发达、设施不完善的贫困偏远地区的宫颈癌筛查推进有十分重要的意义。本研究比较了不同组织病变程度下组织学p16/Ki-67双染结果，并进行了评分，以探讨p16/Ki-67双染在判断宫颈癌前病变患者转归方面的作用，以及p16/Ki-67双染是否可作为宫颈病变病理诊断辅助生物标记物。本研究发现，p16/Ki-67双染阴性患者的病理结果优于双染阳性的患者。本研究显示，p16/Ki-67双染与病理金标准有很好的符合度，其随着病变程度加重双染阳性率升高。因此，对于p16/Ki-67双染阳性的患者，临床上应重点