背景介绍
近年来，将体外肿瘤细胞聚集物作为模拟体内组织环境模型的技术得到了重大的突破。该项技术能够使种植在低吸附圆底孔板中离散的细胞聚集成球体。而球体被认为能够比常规的二维(2D)细胞培养更有效地模拟肿瘤行为。因为与肿瘤实体类似，3D细胞球也包含暴露在球面的细胞和深埋在球内的细胞、都含有增殖和非增殖的细胞，并且球体中心是一个缺氧环境。越来越多的实例已成功地将这种三维球体模型用于各种用途的化合物筛选，以研究潜在的癌症疗法。
然而要获得这类3D球体分析的可靠方法时，是具有挑战性的：
?定位聚焦在一个视野中即可看到完整的球体，以便对每个孔进行批量成像。
?优化化合物和染色处理，确保染料渗透效果，避免干扰球体的位置。
?在整个3D结构中获取具有代表性的图像，最大限度地减少成像平面上下的失焦和背景信号。
?快速分析图像以产生有意义的结果，从中可以得出实验结论。
球体形成和处理
我们使用下面的方法来对肿瘤细胞系HCT,DU和HepG2进行细胞成球。在37℃和5%CO2条件下，细胞在培养瓶中培养。然后消化，并使用含有适当浓度胎牛血清的细胞培养基重悬细胞。然后以每孔-个细胞的浓度将细胞悬液铺设在96孔或孔U型底的黑边底透板中，可使用Corning和两种型号的板材。培养24小时后，每孔底部细胞开始形成单一的球体。继续在37℃和5%CO2条件下连续培养细胞2-4天，直至细胞球尺寸符合实验要求（图1）。球体可以培养更长的时间，但球体过大会阻碍染色渗透，以致最中心细胞无法成像。
图1在高通量筛选环境中测试球体的工作。[单个球体可以在96孔或孔的平板上生长，用化合物处理，然后用混合染料染色，这种染料可以不用水洗就可以成像。如果需要，也可以固定球体。（右）使用ImageXpress显微共聚焦系统上的延时成像功能在63小时内拍摄了HCT细胞的透射光图像，以显示球体（10倍物镜）的形成。]
本应用手册描述了用于测定抗癌化合物（依托泊苷、紫杉醇和丝裂霉素C）效果的分析方法。球体处理过程首先在孔中加入浓度为10倍的化合物，然后孵育1-4天，这取决于所研究的药物作用机理。较短的药物作用时间用于研究细胞凋亡，较长的药物作用时间用于多参数细胞*性研究。对于超过2天的药物处理，化合物以1倍浓度每2天更换一次。
这里举例来源于优化的HCT球体分析，该方法用于评估球体形态变化以及球中凋亡细胞的发生率。在完成药物化合物处理过程后，所有染料混合在一起，以4-6倍浓度的条件直接加入到每孔中进行染色。染料无需洗涤过程，以避免对细胞球的位置和完整度的影响。
使用ImageXpress共聚焦高内涵成像系统的10倍或20倍物镜对球体进行成像。为了分析细胞在整个三维结构中的反应，我们从球体内部不同Z轴深度收集图像，以创建一个“stack”图像。然后使用数学算法将这些图像组合或“堆叠”成一个二维投影图像。该算法使stack中每一层图像中亮度最高的像素保持在生成投影的图像中(图2)。
图2在z平面上获得了一组共聚焦图像，其跨度约为球体深度的一半（左）。在任何一层Z轴图像上，只有球体的部分细胞是聚焦的，因此为了便于分析，图像被堆叠成一个二维图像，以合并聚焦区域（右）。
ImageXpress共聚焦成像系统
可生成更清晰的图像，
以实现更精确的Z轴分割
在对球体进行Z轴成像方面，共聚焦成像比宽场成像提供了更薄的Z轴切层。这大大减少了被采集平面上方和下方荧光发射物体产生的背景干扰而产生的光晕效果。它还提供亚细胞水平或细胞之间的精细细节的更好分辨率。使用共聚焦成像通常可以实现更精确的分割。在对球体的重复实验中，从宽场图像中分割出的细胞核数量比共聚焦图像中的细胞核数量低约20%(图3)。
图3(上图)用宽场系统拍摄的15幅HCT球体图像的最佳聚焦投影。软件分割计算出个核。由于球体边缘的未聚焦荧光和中心的弱细胞导致畸变，细胞核丢失。(下图)用共聚焦系统拍摄的HCT球体的15幅图像的最佳聚焦投影。更精确的数字是个核。
细胞凋亡法筛选抗癌药物
有一类抗癌药物以外源性凋亡途径为靶点，引发细胞死亡。为了证明细胞凋亡检测的有效性，HCT球体在96孔板中培养3天，用4种不同抗癌化合物的梯度稀释溶液处理24-48小时。在化合物处理结果后，用Life公司的CellEventCaspase和MitoTracker橙色试剂染色来检测细胞凋亡情况。染色过程是将所有染料混合在一起，以4-6倍浓度的条件直接加入到每孔中进行染色，其中包含Hoechst核染色试剂。染料无需洗涤过程，以避免对细胞球的位置和完整度的影响(图4)。
图4(上图)HCT球体图像批量成像每孔的缩略图，在96孔板上用化合物处理，用10倍物镜成像。Hoechst染色的细胞核(蓝色)上覆有细胞事件caspase3/7凋亡标记物(绿色)。未经处理的对照样本在第4列中。在第5-7列中，caspase3/7信号明显，其中紫杉醇从a行的1μM连续按照1:3的稀释比例进行稀释(重复3次)。(左)将11个z平面组合成二维最大投影图像，并用一个简单的定制模块进行分析。原始图像显示低和高程度的凋亡及其相应的分割掩模(皇家蓝=细胞核，粉红色=凋亡细胞)。(右图)通过将凋亡量与未经处理的球体相比标准化并绘制在图表上，可以看出紫杉醇(绿线)诱导凋亡的浓度远低于丝裂霉素C或足叶乙甙。
线粒体膜电位的多重筛选分析
在上面的细胞凋亡筛选中，线粒体膜电位也可以做为筛选条件进行多参数的评估。通过向染料混合物中添加MitoTracker橙色，即可对球体进行线粒体膜电位进行评估。另外，通过影响线粒体代谢来抑制肿瘤生长的药物也可以使用该方法来进行研究。
下面展示了一种对抗霉素A的筛选方法。抗霉素A是线粒体膜电位的强效干扰剂。经过4小时的药物处理后，根据球体细胞内的橙色的强度，可以检测到线粒体的健康状况。如图5所示，MitoTracker球体内部的线粒体信号很弱，要么没有完全穿透到大球体的中心，要么中心的细胞没有健康的线粒体。
图5抗霉素A对线粒体的*性作用。(左)Hoechst(蓝色)和MitoTracker(橙色)图像的叠加，图中球体经抗霉素A处理，浓度依次递增为1、22、67和nM。(右图)球体内线粒体的平均强度值显示了药物的作用。
微板中三维球体的快速筛选
三维细胞球的培养能够产生大小一致的人癌细胞球体，并且能够使用自动化的高通量、高内涵成像技术筛选药物处理后的球体反应，这是筛选化疗药物候选物相关测试的重要一步。ImageXpress共聚焦系统和MetaXpress软件允许快速成像和分析微板中的3D球体，以监测抗癌药物诱导的凋亡和线粒体*性，来进行候选药物的筛选。
ImageXpress?MicroConfocal
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主要特点
?在20倍物镜下只需要一个视野即可获得完整的球体。
?支持在96孔板或者孔板中进行3D成球实验。
?使用共聚焦成像精确检测细胞反应。
?可通过只保存z平面图像的2D投影来节省存储空间。
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