单细胞作为生命健康研究的前沿方向，随着微流控、高通量测序和质谱等技术发展而发展，目前还没有达到产业或行业的规模，但已初具完整产业链形态，我们将单细胞产业上中下游进行聚合，以“产业”的维度整体来分析，并绘制出单细胞产业图谱。
图1单细胞的产业链图谱
早期的单细胞以早期的单细胞以RT-PCR技术为主，后续逐渐被测序（单细胞基因组和转录等）取代，逐渐从低通量发展到高通量（如蛋白组方面的质谱技术等）。
全球单细胞测序技术研发从年开始起步，里程碑事件是汤富酬教授发表了世界第一篇单细胞mRNA测序的文章。年后，美国单细胞高通量测序公司10xGenomics和MissionBio相继成立。年，Fluidigm公司推出了全球第一款单细胞RNA测序自动化样品制备系统。年，BDBiosciences发布了BDRhapsody单细胞分析系统，克服了传统方法学上的局限性，能够对成千上万个单细胞的数百个表达基因同时进行数字定量。
图2单细胞的技术发展历史
国内单细胞测序技术的应用从年开始起步，大部分在科研阶段，部分临床应用在初步探索阶段，包括胚胎植入前遗传学检测（PGS/PGD）、外周循环肿瘤细胞检测（CTC）等。例如年12月，国内首例应用单细胞扩增技术（MALBAC）同时进行PGD/PGS，并成功阻断了遗传性耳聋的健康医院诞生。年2月，国内首例采用单细胞高通量测序技术阻断了婴儿家族性甲状腺癌遗传的第三代试管婴儿顺利诞生。具体产业链及代表企业分析如下。
单细胞测序主要如下工作流程：单细胞制备、单细胞分离和文库制备、测序、生物信息分析。分为上游（单细胞制备、分选、文库制备和测序）、中游（测序服务和生物信息分析）和下游分析（应用）。
细胞制备是单细胞测序的第一步，必须要制备高质量的单细胞悬液。样本制备的具体方案因组织类型各异，例如血样，可以采用密度梯度离心的方法；对于组织样本，通常采用机械法或酶解法，常用的消化酶包括accutase,elastase,collagenase以及商业化包装的组合酶。
伯豪生物是市场上较早提供单细胞悬液制备服务的公司，目前开展了人外周血液细胞：如单核细胞（PBMC）、淋巴细胞和粒细胞等；肿瘤样本：如肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌等肿瘤组织；活检组织样本：如肝，肺，肾，皮肤等组织；以及多种大、小鼠组织或器官的单细胞悬液制备。针对珍贵冻存人组织样本及很难制备高质量的单细胞悬液的一些组织样本，伯豪生物可绕过酶解消化等步骤，通过机械方法抽提细胞核，进行单细胞核测序，可获得更好的数据质量和更高成功率。
在单细胞分选和建库方面，目前市面上主流的平台厂商包括BDBiosciences和10xGenomics。
10xGenomics的仪器发布时间较早，年就推出了具有代表性Chromium单细胞分析系统和试剂盒，BD在次年也紧接着推出了Rhapsody单细胞分析系统和试剂盒。不过，相比10xGenomics，BDRhapsody的捕获效率更高，因此可适当降低对起始样品的活性要求。自年为世界带来第一台商用流式细胞仪以来，BDBiosciences已逐步形成了可提供从单细胞分选、单细胞分析到单细胞多组学应用的“三大单细胞技术平台”。
还有一些技术平台因其独树一帜的应用特色在市场上占据一席之地，Fluidigm就是其中的典型代表，其在年就推出了C1单细胞全自动制备系统，至今还是经典产品。相比BD和10x平台，C1的系统开放性、兼容性和可扩展性较好，可支持用户在其平台上做自定义开发，丰富单细胞的应用生态。此外，BD和10x平台都采用UMI（UniqueMolecularIdentifier）+CL（CellLabel）技术进行单细胞及初始转录本的标记，与SMART-Seq+FluidigmC1相比，可使大规模scRNA-Seq的基因表达定量结果几乎不会受PCR偏好影响而更精确，且可实现更高的细胞通量（个细胞vs.个细胞）。
以BDRhapsody技术为例，利用卡式芯片在磁性的寡核苷酸条形码标记的微球上实现单细胞捕获和mRNA转录本的分子标签，然后将这些微球合并到单个管中用于cDNA扩增和文库构建。可满足~个细胞的自动分选、扩增及建库。
此外，该技术使用带有寡核苷酸的高质量抗体（Ab-oligos），这条寡核苷酸带有抗体特异的条形码，细胞在经过Ab-oligos标记后，可在单细胞水平同时获得转录组和蛋白表达。除以上企业，MissionBio公司在年推出Tapestri平台，对单细胞DNA和蛋白质同时测序。
国内致力于开发基于微流控的单细胞分析系统的企业较少，包括新格元生物、万乘基因等，试剂盒研发企业包括寻因生物等。年2月，浙江大学医学院干细胞与再生医学中心的郭国骥教授团队在Cell上刊文，宣布自主研发国产化的高通量单细胞测序平台Microwell-Seq，有望将单个细胞测序成本降低至2元，目前尚未投入商用。
在单细胞制备和分选后，根据转录组、基因组、表观组等不同单细胞组学的应用需求，可采用不同的方法进行文库制备，包括使用商用试剂盒和结合单细胞分选平台。
试剂盒方面，以单细胞基因组测序为例，单细胞分选后的建库流程包含全基因组扩增（WGA）以及常规基因组测序文库的制备等步骤。其中又以WGA最为关键，不仅要求较高的扩增效率，还要求良好的覆盖均一性和较低的扩增错误率及偏好，通常会采用商用的WGA试剂盒进行，供应商有Sigma-Aldrich、Qiagen、亿康基因（Yikon）等，一般都是基于多重置换扩增（MDA）、多次退火环状循环扩增（MALBAC）和简并寡核苷酸引物PCR（DOP-PCR）等原理。而对于单细胞转录组测序，基于试剂盒的建库流程以SMART-Seq和SMART-Seq2最为经典。这两种技术均是在单细胞分选后进行全反转录扩增（WTA）获得单细胞cDNA文库，再进行cDNA预扩增（可选）或直接采用常规基因组测序文库的制备等步骤。SMART-Seq和SMART-Seq2由Illumina公司、路德维格癌症研究所的理查德桑德伯格实验室和卡罗林斯卡医学院共同开发，目前由TaKaRa子公司Clontech实际经营。
结合平台方面，BDRhapsody和10xGenomicsChromium除了能够高效地进行单细胞分选之外，也已经集成了后续所需的建库流程，包括单细胞反转录扩增、cDNA预扩增和测序文库的构建，使得整个工作流程的效率大大提高。当然，这些平台亦需配套专门的试剂盒来完成整个文库制备的工作流程。
对于单细胞测序数据的产出量和质量，影响的因素有很多，例如单细胞分离效果、提取的DNA或RNA的质量、扩增出的全基因组（转录组）的覆盖度和一致性、文库的质量、上机前的文库量等。因此，为了得到更高的数据产出及质量，单细胞测序整个流程中各个步骤的质检必不可少。在中华医学会主办的《中华医学杂志》发表的《二代测序技术在肿瘤精准医学诊断中的应用专家共识》中，明确提出“应对抽提后和文库构建后的核酸样本进行质控”。
目前，为了确认NGS文库的大小分布，一般使用琼脂糖凝胶电泳和微流控片段分析仪作为主要手段。为了确认浓度，还需要配备实时荧光定量PCR仪和Qubit荧光定量仪。对于一般医生而言，从文库制备到质量控制的操作是一系列复杂的手工作业。而且单样本的两项质控的总体成本高，是临床基因检测应用的第一步痛点。
对于全自动文库质控平台，包括美国Agilent的2Bioanalyzer、国产BIOPTIC的Qsep（厚泽生物独家代理）。相对而言，Qsep系列全自动核酸片段分析仪利用毛细管电泳原理进行核酸分离，可以提供从gDNA、RNA到cDNA再到文库的全自动质检解决方案，助力单细胞测序实验，以得到良好的测序结果。在bp范围之内，Qsep系列全自动核酸片段分析仪的分辨率可达到1%，该设备最低检测限为1pg/μL，对于样本浓度极低的用户也是非常友好的。此外，通量灵活，可以检测1-间任意个数的样本；仪器的软件操作简单，初学者培训5分钟即可上手。
单细胞测序：在经过单细胞分选、捕获、扩增和建库后，即可进行测序。针对基因组、RNA组、表观组等分析。目前单细胞主流测序平台以Illumina为主，早在年，10xGenomics的单细胞分析GemCode推出后，与Illumina及QIAGEN达成上游战略合作。2年后，华大智造（MGI）旗下的测序仪开始和10xGenomics展开合作。
单细胞蛋白组质谱：除了上文提到的BDRhapsody可同时实现对mRNA和蛋白质测序外，通过质谱流式细胞术（MassCytometry），TOF-SIMS、MALDI等技术等也可以对单细胞蛋白质组进行分析，一方面无需进行蛋白标记，另一方面可实现多组分的同时精确定量分析。平台包括BD公司的FACSCalibur和Fluidigm公司的CyTOF等。国内单细胞蛋白分析的代表企业包括宸安生物和普罗亭等，宸安生物专注单细胞质谱流式诊断设备、试剂和软件开发，普罗亭则以服务为主。
目前单细技术应用主要集中在基础研究（54%）和临床科研（41%），药企研发仅占5%，仍有很大的市场开拓空间。
1）、降低对操作人员的技术要求，提高批次通量和处理细胞数，缩短实验流程时间。2）、降低仪器和配套试剂的成本。提升仪器的自动化水平，减少人工干预。3）、保留细胞的空间位置信息，提高捕获细胞的能力，尤其是特种细胞。4）、对样品中细胞活性和数量要求比较苛刻，且对数据质量的影响较大，需要有更好的容错性和稳定性。5）、基于多组学应用需求进行单细胞分选和建库，例如整合单细胞基因组和转录组测序需求进行单细胞的分选以及建库。